Cronograma Aula 20/04 - Coloração de Gram (bactérias gram positiva e negativa)
CENTRO DE EDUCAÇÃO PROFISSIONAL “GOV. MÁRIO COVAS”
Curso: Meio Ambiente
Disciplina: Microbiologia
Data: 19/04/2013
Profa.: Ana Olívia Fernandes
RT: Marili Filizatti
Aula Prática 3. “Coloração de Gram”
1. Objetivos
a) Identificar bactérias Gram-positivas e Gram-negativas através da coloração de Gram.
b) Identificar as formas e arranjos das bactérias vistas ao microscópio óptico.
2. Introdução
A coloração de Gram é uma coloração diferencial, através da qual as bactérias são classificadas em Gram-positivas e Gram-negativas, dependendo na retenção ou não do corante cristal-violeta.
A parede celular das bactérias Gram-positivas difere-se das bactérias Gram-negativas pela presença de uma camada espessa de peptidioglicano e pela ausência de uma membrana externa. Esta diferença de constituição da parede celular é a base da coloração de Gram, uma técnica que permite diferenciar, principalmente, a morfologia das bactérias. E é importante nas análise de amostras clínicas.
A coloração de Gram consiste em tratar as bactérias sucessivamente com cristal violeta, lugol, álcool-acetona e fucsina (ou safranina). Tanto bactérias Gram-positivas quanto Gram-negativas absorvem de maneira idêntica o corante cristal-violeta e o fixador (lugol), adquirindo uma coloração violeta devido à formação de um complexo cristal violeta-iodo, insolúvel, em seus citoplasmas. Segue-se um tratamento com um solvente orgânico, o etanol-acetona (também chamada de solução descorante). O solvente dissolve a porção lipídica das membranas externas das bactérias Gram-negativas e o complexo cristal violeta-iodo é removido, descorando as bactérias. Nas Gram-positivas, esse corante é retido e as células permanecem coradas. Em seguida, a amostra é tratada com um corante secundário, a fucsina básica (ou safranina). As bactérias Gram-positivas aparecerão coradas em violeta escuro e as Gram-negativas em vermelho ou rosa escuro.
3. Material e métodos
3.1 Reagentes
Solução de cristal violeta, solução de lugol, Solução de fucsina básica ou safranina, solução álcool-acetona.
3.2 Materiais
Amostras de bactérias da mucosa bucal, iogurt, lâminas, swabs, óleo de imersão, alça de inoculação (de platina) e lamparinas.
3.3. Preparação da amostra
a) limpar bem uma lâmina de vidro com álcool
b) amostra de iogurt: com o auxílio de uma alça de inoculação (de platina), coletar alçadas da amostra e coloca – lá sobre a lâmina espalhando-a para formar uma película bem fina
c) amostra da mucosa bucal: com o auxílio de um swab, passe-o na mucosa bucal raspando suavemente e em seguida espalhe sobre a lâmina
d) Deixar a lâmina secar ao ar ou passar três vezes sobre a chama da lamparina para fixar a amostra
e) proceder a coloração
3.4 Coloração
a) coloque a lâmina com o esfregaço sobre um suporte
b) cubra a lâmina com cristal violeta e deixe agir por 1 minuto
c) retire o excesso de corante e cubra a lâmina com lugol e deixe agir por 1 minuto
d) lave a lâmina com um jato fraco de água corrente
e) cubra a lâmina com solução álcool-acetona deixe agir por 20 segundos
f) cubra a lâmina com fucsina e deixe agir por 30 segundos, e novamente lave a lâmina
g) seque cuidadosamente a lâmina do lado oposto ao do esfregaço com papel absorvente e deixe a lâmina secar ao ar
f) leve a lâmina ao MO e observe em objetiva de 40x e depois em imersão(não esqueça de colocar uma gota de óleo para imersão sobre o esfregaço)
Gram-positiva Gram-negativa
4. Responda
a) Faça um desenho esquemático do que foi visualizado no MO, mostrando a forma e o arranjo bacteriano e sua coloração.
b) Fale sobre o fundamento da técnica de Gram.
Lembre-se: Ao terminar a aula, lave e guarde cuidadosamente as lâminas em locais indicados pelas professoras, retorne a objetiva de menor aumento e desligue o microscópio (para não desperdiçar a vida útil da lâmpada e energia).
Bom trabalho!